凋亡途径检测口腔材料生物相容性的探讨

凋亡途径检测口腔材料生物相容性的探讨

战德松 发表于 2008年11月

　　【摘要】文章在简要介绍口腔材料生物相容性的概念、传统检测方法及其与细胞凋亡的联系后，重点探讨了目前对细胞凋亡的认识及检测方法的研究进展。文章从口腔材料生物相容性传统检测方法的利弊入手，通过对细胞凋亡概念、中心执行者caspase的概念、及其引起细胞凋亡的通路的认识，了解到caspase-3是通路下游的关键分子。总结以往细胞凋亡的检测方法后，旨在探索利用细胞凋亡途径作为口腔材料生物相容性检测的可能性。
　　【关键词】凋亡，口腔材料，生物相容性

生物性能包括生物安全性、生物相容性和生物功能性三种性质（现ISO标准是将生物安全性包含在生物相容性之中）。生物相容性是指材料在宿主的特定环境和部位，与宿主直接或间接接触时所产生相互反应的能力。是材料在生物体内处于静动态变化过程中，能耐受宿主各系统作用而保持相对稳定，不被排斥和破坏的生物学性质[1]。通过体外试验揭示材料与组织之间的反应性质，即在离体试验中，通过对基因、细胞、血液及蛋白质等各种生理物质进行观察分析，了解材料与组织的反应关系。
　　根据1982年美国国家标准学会和牙科协会（ANSI/ADA）公布的评价生物相容性实验标准草案，评价生物相容性的实验方法有全身毒性试验（口服法）、急性全身毒性试验（静脉注射法）、吸入毒性试验、溶血试验、皮下植入试验、骨内植入试验、过敏试验等[2]。细胞培养法作为检测材料毒性的手段（亦称为细胞毒性试验）正日益受到人们的广泛重视。细胞毒性试验在评价材料生物相容性地位已得到公认[3]。传统细胞毒性测试采用人工血小板计数的方法测存活细胞个数，受人为、试验环境因素影响导致误差大，试验周期长。而目前国内常用的细胞毒性评价实验MTT法虽然具有快速、简便、灵敏等优点，但其经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这使工作量增加，对实验结果的准确性、重复性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有危害。所以人们开始着眼于材料生物相容性检测新方法的研究。
　　在离体研究中，口腔金属材料的溶出产物如Ni，Gr，Mo等显示出不同程度的细胞毒性[4-6]，而由此引发的细胞死亡机制还未阐明。一般而言，细胞死亡有两种不同的模式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）[7]。有学者检测了Nitinol合金对鼠骨肉瘤细胞Ros-17死亡率和凋亡率的影响，结果表明细胞的死亡类型可能与材料的生物相容性有关[8]。战德松等在磁性附着体中铁素体不锈钢引起小鼠成纤维细胞L929的死亡模式中得出结论：金属材料引起细胞的死亡方式主要是凋亡，并具有浓度依赖型及时间依赖型特性[9]。凋亡因其可以从形态、分子、蛋白、基因等不同深度层次进行检测，从实验的精确性和重复性角度，显示了其作为检测口腔材料生物相容性的新方法的优越性。

一、细胞凋亡概念
　　1842年，Carl Vogt[10]首次认识到在生理环境下，细胞死亡是通过一种“程序化”的方式进行的。1965年，Lockshin[10]提出了“程序性细胞死亡”的概念。1972年，Kerr等[11]首先提出细胞凋亡（apoptosis）的概念。细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是指为维持内环境稳定由基因控制的细胞自主的有序性死亡，是多细胞生物受着高度调节的一种生理性细胞死亡，是广泛存在的一种由细胞特定基因编码的以细胞DNA降解为特征的无明显细胞溶解的细胞自杀过程，多种分子参与这个过程。细胞凋亡一词用希腊语“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落一样，是一种自然的生命现象[12]，在保持机体稳态方面发挥积极作用。细胞凋亡现象是20世纪末生命科学的一个重大发现，他为人类理解生存和死亡这对矛盾在生命中如何统一起来提供了一个崭新的思路，加深了人类对生命现象的认识。已有研究表明，在各种疾病如癌症、自身免疫、不规则的神经变性[13，14]和生理细胞死亡中，细胞凋亡起到重要作用。细胞凋亡是细胞的一种死亡方式，不同于细胞坏死，它是细胞的基本生命特征，是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。凋亡是多细胞生物为更好地适应环境牺牲少数细胞保存整体的一种方式。在细胞凋亡过程中，caspase作为凋亡的中心执行者，起着至关重要的作用。

二、Caspase引起的细胞凋亡
1、Caspase
　　Caspase全称为门冬氨酸特异半胱氨酸蛋白酶，属于ICE/CED3蛋白酶家族成员，目前发现至少14种之多，分别命名为caspases-1~caspases-14[15]它通过介导和执行死指令在细胞凋亡过程中发挥重要作用。
　　Caspase在凋亡过程中大致分为启动caspase和效应caspase两类。启动caspase主要是caspase-8、9、10；效应caspase主要是caspase-3、-6、-7等，caspase是一类酶原，正常状态下以无活性的结构存在，caspase-3的激活将导致DNA修复蛋白细胞骨架蛋白及其他caspase相关蛋白的裂解，在此过程中，caspase家族成员形成一个蛋白级联反应，使细胞DNA损伤，结果形成凋亡小体[16]。酶前体可在天冬氨酸位点上被切断成3部分H2N-端是抑制区域被移去，另一端COOH-端断裂成一大一小亚单位称为死亡区域，二大二小亚单位结合成活化酶，可以作用于下游效应caspases，这种级联反应（spases cascade）[17]的进行有赖于caspases的调节蛋白、辅助因子、反馈关系和阈限等控制。当凋亡外界信号只作用于caspases前体（procaspases），前体可活化蛋白酶激发因子（initiator of caspases），激发因子可以活化蛋白酶效应因子（effector of caspases），然后作用于底物蛋白[18]，其作用包括以下3个方面：①凋亡信号传导级联反应过程的一个关键环节；②可直接破坏细胞结构，如核层蛋白（laminine）和凝胶蛋白（gelsolin）等，使蛋白分解引起凋亡；③对蛋白酶的调节功能，如灭活细胞凋亡的抑制剂作用、激活下游的核酸内切酶等。总的来说，在蛋白酶级联切割过程中，caspases-3处于核心位置[19]，不同的蛋白酶分别切割其酶原，使其激活，活化的caspases-3又进一步切割不同的底物，最终使细胞走向凋亡。
　　目前发现至少两条途径可激活caspase家族，一条是细胞内信号途径，通过线粒体细胞色素C释放到胞浆，与caspase-9、凋亡激活因子（APAF-1）及dATP形成凋亡体激活caspase-3，降解DNA酶的抑制剂（ICAD）而激活DNA酶（CAD），后者导致DNA降解成寡聚核苷酸片段和进一步的染色体浓缩[20]。另一条途径称细胞外信号途径，即膜受体介导（Fas、FasL），激活caspase-8，再激活caspase-3介导细胞凋亡。最近又提出了细胞凋亡的第三条途径，即内质网应激，引起内质网Ca2+释放，导致胞浆内Ca2+稳态失衡，激活caspase-12介导细胞凋亡。但凋亡也可发生于没有caspase启动的情况下。如凋亡诱导因子（AIF）在ATP缺失时黄素蛋白从膜内释放到膜外，可导致凋亡发生；AIF可以导致大范围染色质凝聚，同样可以诱导线粒体释放细胞色素C和procaspase-9。Caspase蛋白是凋亡反应过程的执行者，直接激活caspase蛋白引发细胞凋亡。MacCorkle等[21]研究报道，根据caspase-1（ICE）和caspase-3（YAMAy/CPP32）相关蛋白酶的结构特点，重组成含有一个或多个诱导结构域，并命名为“人工死亡开关”，通过激活caspase-1和caspase-3，引起凋亡级联反应，导致细胞凋亡。
　　在哺乳动物细胞，caspase以依赖线粒体和非依赖线粒体两条途径促进细胞凋亡[22，23]。非依赖线粒体途径：通过膜的死亡受体作用，caspase可以被细胞外部因子如FasL或Fas抗体激活，激活的caspase-8激活下游的caspase，从而引起细胞凋亡；内质网通路：内质网参与维持细胞内钙离子内环境稳定、膜蛋白的合成、修饰和折叠，内质网在凋亡信号处理过程中有重要作用[24]。caspase-12存在于内质网，当内质网钙离子动态平衡破坏或过多蛋白积聚于内质网时，可直接激活caspase-12。另外，胞质的caspase-7可转移到内质网表面，进一步激活caspase-12，激活的caspase-12可进一步剪切caspase-3，而引发细胞凋亡，此过程由内质网失常引起，与以膜或线粒体为靶位点的凋亡信号触发无关。依赖线粒体途径：caspase也可以被细胞的内在信号激活，可以导致细胞色素C和线粒体蛋白Smac/Diablo从线粒体释放，细胞色素C和线粒体蛋白Smac/Diablo的释放能明显的促进caspases的活性，并且增加了依赖caspase的DNA的断裂[25]。在死亡受体介导的凋亡途径中，caspase-8除了直接激活caspase-3外，还可直接切割胞质的Bcl-2家族成员Bid前体，形成截断的Bid（truncated Bid，tBid），激活的tBid转位到线粒体，触发bak和bax同源寡聚作用，启动细胞色素C的释放，因此Bid将凋亡信号从死亡受体途径传递到线粒体途径，把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，有效的放大了凋亡信号[26]。而Bcl-2蛋白对caspse-3有拮抗作用[27、28]。线粒体通路和内质网通路也有密切的联系。许多情况下，内质网钙离子释放是线粒体释放细胞色素C的一个早期事件，即依赖内质网的线粒体内钙离子改变是重要的促进细胞色素C释放的信号[29]。细胞凋亡的过程非常复杂，与此有关的caspase对细胞凋亡的调控起着举足轻重的作用。
2、Caspase引起细胞凋亡的通路
　　根据通路中的起始caspase蛋白不同，细胞凋亡途径可分为三种：第一种，死亡受体通路，激活caspase-8[30]；第二种，内质网介导细胞凋亡通路，激活caspase-12[31]；第三种，线粒体介导细胞凋亡，线粒体中的促凋亡蛋白受到凋亡信号刺激，释放到细胞质，激活caspase-9，以及下游的caspase-3，7或6[32]，其最终都能激活凋亡执行者caspases-3，水解各种细胞成份而使细胞凋亡。
2.1线粒体通路
　　此通路由含BH3结构域的Bcl-2家族成员Bid、Bad、Bim、Harikari、Noxa等在接受到胞内的死亡信号后激活。这些含BH3结构域的Bcl-2家族成员与另外的Bcl-2家族成员（Bax亚家族成员Bax，Bak等，主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆）作用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素C（Cytc）和其他蛋白[33]。Cytc的释放是线粒体凋亡路径的主要步骤，在ATP/dATP存在的情况下，Cytc与凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic protease-activating factor，Apaf-1）形成多聚复合体，通过Apaf-1氨基端的Caspase募集结构域（caspase recruitment domain，CARD）募集胞质中的caspase-9前体，并使其自我剪切活化并启动caspase级联反应，激活下游的caspase-3和caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡[34]。
2.2内质网通路
　　内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网在维持细胞内钙离子的稳定以及膜蛋白的合成、修饰和折叠等方面都发挥关键性作用[35]。caspase-12位于内质网膜，内质网钙离子平衡的破坏或者内质网蛋白的过量积累都会诱导caspase-12表达，同时也导致胞质的caspase-7转移到内质网表面。caspase-7激活caspase-12，激活的caspase-12可进一步剪切caspase-3而引发细胞凋亡[36]。
2.3死亡受体通路
　　胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡受体为一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因超家族。其胞外部分都含有一富含半胱氨酸的区域，胞质区有一由同源氨基酸残基构成的结构，有蛋白水解功能，称“死亡区域”（deathdomain）。“死亡区域”使死亡信号得以进一步传递而启动凋亡。已知的死亡受体有五种：TNFR-1（又称CD120a或p55），Fas（CD95或Apo1），DR3（死亡受体3，又称Apo3，WSL-1，TRAMP，LARD），DR4，DR5（Apo2，TRAIL-R2，TRICK2，KILLER）。前三种受体相应的配体分别为TNF，FasL（CD95L），Apo-3L（DR3L），后两种均为Apo-2L（TRAIL）。死亡配体与死亡受体激活无活性的pro-caspase-8变为有活性的caspase-8，激活的caspase-8不仅可激活下游效应caspase裂解多种蛋白质而最终导致细胞凋亡。同时还可以降低线粒体内膜电位使Bc1-2家族成员裂解，导致Cytc的释放[37]，后者可与Apaf-1结合，在dATP的存在下活化caspase-9，caspase-9能激活下游效应caspase，如caspase-3[38]。在这里，caspase-8起到效应的放大作用。三条凋亡通路最后都有caspase的激活，在caspase-3汇合从而引起细胞结构和保护成分的蛋白水解发生细胞凋亡，这说明caspase是诸多调控通路的关键。
3、Caspases-3
3.1 Caspase-3的结构特点
　　Caspase家族属于半胱氨酸基天冬氨酸基-特异性蛋白酶。围绕活性中心位点半胱氨酸的氨基酸残基是保守的，都是QACRG五肽，分子内都含有相对分子质量约为20×103（p20）和10×103（p10）的两个亚单位。这两个亚单位是这些酶发挥生物学活性所必须的。1994年Fernades-Alnemr等在Jurkat T细胞系首先克隆出cpp32 （caspase-3）基因，分为cpp32α、cpp32β，两者的阅读框均由831个核苷酸组成，编码277个氨基酸，相对分子质量约为32×103[39]。
3.2 Caspase-3的分子生物学特性
　　Caspase-3以其酶原形式合成，酶原N端有一前区，与caspase-8、9等起始型caspase相比，caspase-3及其他下游caspase的前区较短，不含有死亡效应结构域（DED），必需在起始型caspase被激活后才能进一步被激活[40]。在caspase-3酶原中存在一安全扣调节三肽，由ASP-ASP-ASP组成，位于大、小亚基结合处可变形的环区中，凋亡发生时该三肽残基在胞质内被酸化裂解，在caspase-3的触发活化时起重要作用，因而它可能是整个凋亡级联反应的一个关键调节点[41]。caspase-3激活时在ASP位置切开，形成大、小亚基（α和β），同时去掉N端的前区，进而α与β结合成异二聚体（α/β），酶的两个活性位点于大、小亚基的结合部、异二聚体还将进一步通过次级键形成四级结构（α/β）2发挥作用。caspase酶原被剪切或酶发挥其作用时，其辨认序列从N端至切割位点最少要4个氨基酸，而且P1位点必须是ASP（D）。caspase-3发挥其作用时在DExD（X代表任何氨基酸）后剪切，如底物PARP（聚二磷酸腺苷-核糖多聚酶）被caspase-3在DEVD↓G处剪切。caspase蛋白酶内部的剪切位点与酶原自身激活或激活其他的caspase并且放大caspase级联是一致的。caspase-3包括有含活性位点半胱氨酸残基的QACXG模体（motif）和含组氨酸残基的SHG模体，二者定位在大亚基内，His的咪唑基团在Cys侧链的极化激活中有重要作用。精氨酸残基（Arg341和Arg179）位于大、小亚基之间的界面上，它们形成S1亚位点，与P1位点的天冬氨酸结合。caspase-3的三维结构揭示大、小亚基共同参与构成其特异性结合腔，其中S4亚位点是最主要的特异性决定族，只由小亚基构成[42，43]。
3.3 Caspase-3的活化及作用底物
　　正常情况下，胞质内caspase-3以无活性的酶原形式存在，只有当细胞凋亡时才被激活为有活性的caspase-3。Fas介导的细胞凋亡中发现存在caspase-3的活化，丝氨酸蛋白酶抑制剂可同时抑制细胞凋亡和caspase-3的活化，Saureus V8丝氨酸蛋白酶可特异地对P3位点进行切割，激活caspase-3。近来，Zou[44]纯化并克隆出凋亡蛋白酶激活因子（Apafs），Apaf-1蛋白与线虫的CED-4蛋白极为相似，线粒体释放的细胞色素C与Apaf-1结合，从而诱发caspase-3激活。Bcl-2则可抑制细胞色素C的释放，抑制caspase-3激活和细胞凋亡。caspase家族其他成员，如caspase-8的激活亦需要线粒体细胞色素C的释放，蛋白磷酸酶抑制剂花粤海绵诱癌素（calyculin）A可阻止细胞色素C的释放和细胞凋亡，提示蛋白磷酸酶在调节细胞色素C的释放和细胞凋亡中起重要作用[45]。由上可见，caspase-3的初始活化可能是由一个或多个胞质蛋白酶、丝氨酸蛋白酶与Saureus V8蛋白酶有同样活性的蛋白酶及caspase-3亚家族其他成员等所介导的，细胞色素C、Apaf-1、和Bcl-2对其活化起重要作用。caspase-3的作用底物包括聚二磷酸腺苷-核糖多聚酶、DNA依赖性蛋白激酶催化亚基DNA-Pkcs、类固醇调节组件结合蛋白（SREBP）SREBP1和SREBP2、相对分子质量为70×103的UI核糖蛋白UI-70K、GTP酶Rho家族的GDP分离抑制剂D4-GDIt和异核核糖核蛋白C1及C2等，这些底物多是细胞中的功能蛋白质，参与DNA修复、mRNA裂解、类固醇生物合成的细胞骨架重建。
3.4 Caspase-3与细胞凋亡。
　　Caspase-3处于细胞凋亡的下游，经典的细胞凋亡途径有两条，分别是细胞外途径（细胞表面死亡受体途径）和细胞内途径（线粒体引发途径）。在细胞外途径中，死亡信号的传导依赖于死亡配体与受体（如TNF-α和TNFR，FasL和Fas）的结合，接着死亡受体的死亡结构域（DD）与信号传导分子（如FADD）结合，而FADD又可与caspase-8酶原的DED相连接，形成死亡诱导信号复合物（DISC），随之caspase-8被激活，它通过裂解BID使线粒体释放细胞色素C，或直接作用caspase-3及其他下游的caspase。在细胞内途径中，细胞内的死亡信号，如DNA损伤、毒素和ATP耗竭等均可诱发线粒体释放细胞色素C。细胞色素C、Apaf-1、dATP和caspase-9酶原结合形成凋亡复合体，caspase-9被释放并激活，接着下游的caspase-3等被激活降解底物使细胞凋亡[40，46]。Caspase基因的剔除研究可为caspase-3在凋亡级联反应中的地位提供证据。如神经系统中，caspase-9被剔除时，细胞对药物、毒素和辐照不敏感，caspase-3不被激活；在caspase-8缺陷的细胞中肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员诱导的死亡信号也不会使细胞死亡，但是二者却不互相影响，在无caspase-9的细胞中，TNF和Fas介导细胞凋亡时caspase-8仍可激活caspase-3，而且在caspase-3的酶原上也被证明有caspase-8的剪切位点。这些事实说明，在细胞凋亡中存在着不同的死亡信号传导途径，caspase-3则可能是细胞凋亡下游的关键执行者。有证据表明，细胞凋亡的某些特征性标志，如染色体凝聚和DNA片段化等，均与caspase-3有着直接的关系[40，42]。除此之外，在多种细胞和各种刺激因素的作用下，caspase-3都被证明是凋亡的关键执行者。如有研究用人类结缔组织因子重组体（r-hCTGF）、包含有RGD模体的人工合成多肽、IL-4、香烟提取物（CSE）等处理细胞后，都可见caspase-3的激活，细胞都发生凋亡的典型变化，并且凋亡可被caspase-3抑制剂所抑制[47，48]。